Proses fermentasi dibagi menjadi dua tipe yaitu fermentasi aerob dan anaerob. Fermentasi aerob akan menghasilkan asam laktat dan pada proses anaerob akan dihasilkan alcohol. Proses fermentasi untuk mengubah glukosa menjadi bio-ethanol dengan menggunakan yeast. Alkohol yang diperoleh dari proses fermentasi ini, biasanya alkohol dengan kadar 8 sampai 10 persen volume. Oleh karena itu dalam decade ini telah dikembangkan yeast yang toleran terhadap alcohol dengan kadar lebih besar dari 10%. Karena ragi selama ini apabila proses fermentasinya sudah diperoleh alcohol dengan kadar 10%, ragi akan mengalami lisis karena pengaruh dari alcohol tersebut. Sementara itu, bila fermentasi tersebut digunakan bahan baku gula (molases), proses pembuatan ethanol dapat lebih cepat. Pembuatan ethanol dari molases tersebut juga mempunyai keuntungan lain, yaitu memerlukan bak fermentasi yang lebih kecil. Proses pembuatan entanol dengan bahan baku mollase akan dibahas di potingan berikutnya. Ethanol yang dihasilkan proses fermentasi tersebut perlu ditingkatkan kualitasnya dengan membersihkannya dari zat-zat yang tidak diperlukan.
Langkah yang harus dilakukan untuk memfermentasi adalah menyiapkan wadah yang tidak mempunyai akses udara untuk masuk keluar sehingga proses fermentasi dapat berjalan dengan baik dan sempurna. Kemudian glukosa dan yeast dicampur hingga diperoleh perbandingan yang optimum. Proses fermentasi sudah dapat dilakukan dengan menginkubasi pada kondisi anaerob dengan suhu dimana yeast dapat bekerja optimum. Dalam dekade ini telah dikembangkan bioreactor dimana yeast diamobil pada bioreactor. Keinginan untuk memperoleh proses fermentasi glukosa menjadi bioetanol harus memperhatikan karakter yeast yang digunakan. Sehingga proses fermentasi dapat berlangsung secara optimal dengan memperhatikan parameter fisik pada kondisi optimum yeast bekerja.
Alkohol yang dihasilkan dari proses fermentasi biasanya masih mengandung gas-gas antara lain CO2 yang ditimbulkan dari pengubahan glucose menjadi bio-ethanol dan aldehyde yang perlu dibersihkan. Gas CO2 pada hasil fermentasi tersebut biasanya mencapai 35 persen volume, sehingga untuk memperoleh bio-ethanol yang berkualitas baik, bio-ethanol tersebut harus dibersihkan dari gas tersebut. Proses pembersihan (washing) CO2 dilakukan dengan menyaring bio-ethanol yang terikat oleh CO2, sehingga dapat diperoleh bio-ethanol yang bersih dari gas CO2.
Kadar bio-ethanol yang dihasilkan dari proses fermentasi, biasanya hanya mencapai 8 sampai 10 % saja, sehingga untuk memperoleh ethanol yang berkadar alkohol 95 persen diperlukan proses lainnya, yaitu proses distilasi. Proses distilasi dilaksanakan melalui dua tingkat, yaitu tingkat pertama dengan beer column dan tingkat kedua dengan rectifying column. Destilasi sederhana tidak dapat dilakukan karena etanol-air erupakan campuran azeotrop yang susah disahkan karena mempunyai sifat yang menyerupai. Sehingga diperlukan teknik khusus, salah satu alternatifnya yaitu dengan menggunakan teknologi membrane ( membrane zeolit-kitosan terpolarisasi).
Definisi kadar bio-ethanol dalam % (persen) volume adalah “volume ethanol pada temperatur 15oC yang terkandung dalam 100 satuan volume larutan ethanol pada temperatur tertentu (pengukuran).“ Berdasarkan BKS Alkohol Spiritus, standar temperatur pengukuran adalah 27,5o C dan kadarnya 95,5% pada temperatur 27,5 o C atau 96,2% pada temperatur 15o C. Pada umumnya hasil fermentasi bio-ethanol yang mempunyai kemurnian sekitar 30 – 40% dan belum dapat dikategorikan sebagai fuel based ethanol.
